目前SARS-CoV-2臨床試(shi)驗用脂質納米顆粒的(de)開發

mRNA最早的(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)試劑是季(ji)(ji)銨(an)(an)化(hua)(hua)陽離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)DOTAP結(jie)(jie)合(he)(he)(he)可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)(li)(li)和(he)(he)(he)融合(he)(he)(he)的(de)(de)(de)(de)(de)DOPE，采用(yong)(yong)DNA轉(zhuan)(zhuan)染(ran)[85]，用(yong)(yong)于(yu)(yu)在(zai)(zai)眾多(duo)細胞(bao)類(lei)型(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)轉(zhuan)(zhuan)染(ran)mRNA[86]。盡(jin)管在(zai)(zai)體(ti)(ti)外有效，但永久(jiu)性(xing)(xing)陽離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)季(ji)(ji)銨(an)(an)基團使這些大(da)尺寸的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)復合(he)(he)(he)物(wu)從循環和(he)(he)(he)其(qi)通常靶器官(guan)肺中(zhong)(zhong)(zhong)迅速清除(chu)，并(bing)表現出(chu)毒(du)性(xing)(xing)。今天LNP的(de)(de)(de)(de)(de)先驅(qu)是穩(wen)定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)-脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆粒(li)(SPLP)，它是由融合(he)(he)(he)基因電(dian)(dian)離(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)DOPE與(yu)季(ji)(ji)銨(an)(an)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)陽離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)DODAC結(jie)(jie)合(he)(he)(he)形(xing)(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)，DODAC靜電(dian)(dian)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)并(bing)包(bao)裹(guo)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)DNA，然(ran)后(hou)用(yong)(yong)親(qin)水(shui)性(xing)(xing)PEG包(bao)被，使其(qi)在(zai)(zai)水(shui)介質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)，并(bing)在(zai)(zai)體(ti)(ti)內(nei)給藥時限制蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)細胞(bao)相(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)[87]。DOPE在(zai)(zai)細胞(bao)攝取后(hou)可(ke)在(zai)(zai)內(nei)涵體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化(hua)(hua)，由于(yu)(yu)呈錐形(xing)(xing)，因此可(ke)與(yu)內(nei)涵體(ti)(ti)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)(xing)成內(nei)體(ti)(ti)溶(rong)解離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)對，以促進內(nei)涵體(ti)(ti)釋放(fang)，這是成功遞送的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵事件[17]。然(ran)后(hou)進一步將SPLP開發為含有siRNA的(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)(ding)(ding)核酸(suan)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆粒(li)(SNALP)，包(bao)括四種(zhong)(zhong)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)：離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)化(hua)(hua)而不是季(ji)(ji)銨(an)(an)化(hua)(hua)陽離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、飽(bao)和(he)(he)(he)雙(shuang)層形(xing)(xing)成季(ji)(ji)銨(an)(an)化(hua)(hua)兩(liang)性(xing)(xing)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、DSPC、膽(dan)(dan)固(gu)醇(chun)和(he)(he)(he)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)[88]。除(chu)了與(yu)核酸(suan)靜電(dian)(dian)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)外，SNALPs中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)發揮了融合(he)(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)，并(bing)在(zai)(zai)內(nei)涵體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化(hua)(hua)，與(yu)內(nei)涵體(ti)(ti)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)(xing)成膜不穩(wen)定(ding)(ding)(ding)離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)對。目前已知DSPC有助于(yu)(yu)在(zai)(zai)PEG表面下形(xing)(xing)成穩(wen)定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)層[89]。膽(dan)(dan)固(gu)醇(chun)發揮多(duo)種(zhong)(zhong)作(zuo)用(yong)(yong)，包(bao)括填補顆粒(li)間(jian)隙、限制LNP–蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)相(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)和(he)(he)(he)可(ke)能促進膜融合(he)(he)(he)[90]。可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)(zai)生理pH下呈中(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)(xing)，從而消除(chu)循環中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)任何(he)陽離(li)(li)(li)(li)子(zi)(zi)電(dian)(dian)荷，但在(zai)(zai)pH~6.5的(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化(hua)(hua)，促進內(nei)體(ti)(ti)釋放(fang)，發揮核心作(zuo)用(yong)(yong)。

2018年臨(lin)床(chuang)批準(zhun)的(de)首個siRNA產品的(de)開發(fa)主(zhu)要集(ji)中(zhong)(zhong)在優(you)化(hua)(hua)可(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)，其次(ci)是PEG脂(zhi)(zhi)質(zhi)和LNP中(zhong)(zhong)使用(yong)的(de)四種(zhong)脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)比例(li)，以及LNP組裝和生產程序。根據(ju)分子形狀假設[12,91]，發(fa)現(xian)C18尾(wei)中(zhong)(zhong)不(bu)飽和鍵的(de)最(zui)佳(jia)數量是通過醚連(lian)接(jie)到二(er)甲(jia)胺(an)頭(tou)基的(de)二(er)亞油(you)(you)酸尾(wei)[88]。然而，在亞油(you)(you)酸尾(wei)部引(yin)入單個連(lian)接(jie)體，其具有(you)從(cong)二(er)甲(jia)胺(an)頭(tou)基到連(lian)接(jie)體的(de)優(you)化(hua)(hua)碳數，導致LNP中(zhong)(zhong)可(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)DLin-MC3-DMA的(de)pKa接(jie)近(jin)6.4[92,93]。優(you)化(hua)(hua)的(de)最(zui)后(hou)一(yi)步是將(jiang)MC3/DSPC/膽固醇/PEG–脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)這些脂(zhi)(zhi)質(zhi)摩爾比調節至50/10/38.5/1.5。總體從(cong)DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的(de)這一(yi)優(you)化(hua)(hua)過程需(xu)要在數千種(zhong)制劑中(zhong)(zhong)篩選超(chao)過300種(zhong)可(ke)(ke)電(dian)離(li)的(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)，并導致效價增加200倍和有(you)效劑量相(xiang)應減少，以實現(xian)對靶基因> 80%的(de)持久抑制和允(yun)許治療窗(chuang)，2018年Onpattro™獲得(de)臨(lin)床(chuang)批準(zhun)[94,95]。這種(zhong)為(wei)siRNA開發(fa)的(de)MC3配方(fang)是隨后(hou)開發(fa)LNPs的(de)基礎(chu)，如下所述（圖1），在被批準(zhun)用(yong)于SARS-CoV-2 mRNA疫苗(miao)的(de)遞送后(hou)，LNPs現(xian)在正(zheng)被緊急使用(yong)。

圖1 mRNA脂質納米顆粒結構(gou)。最近使用冷凍(dong)電子顯微鏡(jing)[96]、小角(jiao)中子散射和小角(jiao)X射線(xian)散射[89]進(jin)行的研究表(biao)明，mRNA脂(zhi)質納米顆(ke)粒包(bao)括低拷貝數的(de)mRNA(1-10)，并且mRNA與占據LNP中心核心的(de)可電離脂質結合。聚乙(yi)二醇(PEG)脂(zhi)質(zhi)形成脂(zhi)質(zhi)納米顆粒(LNP)的(de)表面，同時形成雙層(ceng)的(de)DSPC。帶(dai)電荷和不(bu)帶(dai)電荷的膽固(gu)醇和可(ke)電離脂質可(ke)分(fen)布在(zai)整個LNP中(zhong)。其他輸(shu)送(song)系(xi)統的(de)(de)結構示(shi)意圖在最近的(de)(de)綜述中(zhong)提供[14]。

Moderna使用(yong)上述Onpattro制(zhi)劑(ji)中的(de)MC3進行了幾項臨床(chuang)前[97,98,99]和臨床(chuang)研(yan)究(jiu)[97,100]，以遞送核苷修飾(shi)的(de)mRNA編碼免疫原。在這(zhe)些比較(jiao)新的(de)一類可電(dian)離脂(zhi)質與MC3的(de)研(yan)究(jiu)中，MC3后來被確(que)定為可電(dian)離脂(zhi)質[42,101]。這(zhe)個新類別包括Lipid H[42]，它是(shi)Moderna的(de)SARS-CoV-2產品(pin)mRNA-1273中的(de)可電(dian)離脂(zhi)質SM-102[41]（表2）。

使(shi)用針對寨(zhai)卡病毒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼(ma)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)原，MC3 LNP能(neng)(neng)(neng)夠保護(hu)(hu)缺乏I型(xing)和(he)(he)II型(xing)干擾(rao)素(IFN)信號的(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)功能(neng)(neng)(neng)低下(xia)小(xiao)鼠免(mian)(mian)(mian)受(shou)10µg劑(ji)(ji)量(liang)1次或2µg劑(ji)(ji)量(liang)初免(mian)(mian)(mian)-加強免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)設計的(de)(de)(de)(de)(de)(de)致(zhi)死攻擊[99]。在(zai)(zai)預先給(gei)(gei)予(yu)(yu)抗ifnar1阻斷抗體以(yi)建立致(zhi)死模型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)功能(neng)(neng)(neng)正常小(xiao)鼠中(zhong)也獲(huo)得(de)了(le)(le)相似(si)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果。在(zai)(zai)一(yi)系列遞送核苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼(ma)血凝(ning)素(HA)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)原的(de)(de)(de)(de)(de)(de)流感研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)中(zhong)，皮內(nei)遞送的(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3 LNP能(neng)(neng)(neng)夠完全保護(hu)(hu)小(xiao)鼠免(mian)(mian)(mian)受(shou)低至0.4µg單次給(gei)(gei)藥的(de)(de)(de)(de)(de)(de)致(zhi)死性(xing)攻擊，盡管即使(shi)單次給(gei)(gei)予(yu)(yu)高(gao)(gao)達(da)10µg劑(ji)(ji)量(liang)，攻毒后也會(hui)出現體重減(jian)輕[97]。雪貂單次給(gei)(gei)予(yu)(yu)50µg或100µg劑(ji)(ji)量(liang)產生(sheng)(sheng)了(le)(le)較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI（血凝(ning)抑制試(shi)驗(yan)）滴度(du)，非人(ren)靈長類動物單次給(gei)(gei)予(yu)(yu)200或400µg劑(ji)(ji)量(liang)也產生(sheng)(sheng)了(le)(le)較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴度(du)。在(zai)(zai)接受(shou)100µg劑(ji)(ji)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)少數(shu)(23)人(ren)類受(shou)試(shi)者中(zhong)，在(zai)(zai)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)開始時(shi)，所(suo)有(you)受(shou)試(shi)者的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴度(du)均 > 40（who保護(hu)(hu)相關性(xing)），比(bi)基線高(gao)(gao)4倍以(yi)上(shang)。在(zai)(zai)一(yi)項更(geng)大規(gui)(gui)模的(de)(de)(de)(de)(de)(de)1期試(shi)驗(yan)中(zhong)，使(shi)用相同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3 LNPs遞送兩種不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA編(bian)碼(ma)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HA免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)原，肌肉注射100µg的(de)(de)(de)(de)(de)(de)H10N8免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)原導致(zhi)23名受(shou)試(shi)者中(zhong)100%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HAI滴度(du) > 40[100]。盡管未發(fa)生(sheng)(sheng)危及生(sheng)(sheng)命的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)(jian)，但(dan)這23例(li)(li)受(shou)試(shi)者中(zhong)有(you)3例(li)(li)發(fa)生(sheng)(sheng)了(le)(le)重度(du)3級不(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)(jian)。3例(li)(li)受(shou)試(shi)者中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)2例(li)(li)發(fa)生(sheng)(sheng)3級不(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)(jian)（符(fu)合研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)暫停規(gui)(gui)則(ze)）后，停止計劃(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)400µg給(gei)(gei)藥。在(zai)(zai)較低劑(ji)(ji)量(liang)下(xia)，不(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)頻率和(he)(he)嚴重程度(du)降低，但(dan)幾乎每(mei)例(li)(li)受(shou)試(shi)者均發(fa)生(sheng)(sheng)至少1起不(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)(jian)。這些研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)很有(you)前景，但(dan)也強調了(le)(le)在(zai)(zai)不(bu)會(hui)引起問題數(shu)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)良(liang)事(shi)件(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)劑(ji)(ji)量(liang)下(xia)獲(huo)得(de)保護(hu)(hu)性(xing)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)治(zhi)療(liao)窗相對較窄。這讓人(ren)想起MC3前體DLin-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)治(zhi)療(liao)窗窄，需要提(ti)高(gao)(gao)效(xiao)力才能(neng)(neng)(neng)降低劑(ji)(ji)量(liang)，仍然實現有(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因敲低。

表2脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒中(zhong)使(shi)用的可電離脂(zhi)質(zhi)。脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒中(zhong)使(shi)用的可電離脂(zhi)質(zhi)的一個(ge)關鍵特征是(shi)，通過TNS染料結合試(shi)驗測定，LNP中可電離脂質的pKa應在(zai)6-7范圍內(nei)。理論上計算(suan)的大多數可(ke)電離基團的pKa在8-9.5范(fan)圍內，如下(xia)所示(shi)在氮原子上，使用商業軟件理論上估計水(shui)介質(zhi)中的這些值。pKa從理(li)論值下降2-3個點(dian)至TNS值是由于脂(zhi)相(xiang)中(zhong)質子的(de)溶(rong)劑化(hua)能量更高，導(dao)致(zhi)脂(zhi)相(xiang)中(zhong)的(de)pH值比水相高2-3個點，在TNS測(ce)定(ding)期間測(ce)量pH值(zhi)[102]。

由于(yu)(yu)siRNA產品(pin)需要(yao)重(zhong)(zhong)復(fu)給藥(yao)治療慢(man)性(xing)疾病(bing)，人們(men)擔(dan)心MC3中(zhong)二亞油酸烷基尾(wei)的(de)(de)緩慢(man)降(jiang)(jiang)解會導致重(zhong)(zhong)復(fu)給藥(yao)的(de)(de)蓄積和潛在(zai)(zai)毒性(xing)。MC3的(de)(de)生物可(ke)(ke)降(jiang)(jiang)解版本脂(zhi)(zhi)質(zhi)319（表(biao)2）是通(tong)過用(yong)(yong)(yong)在(zai)(zai)體內(nei)易于(yu)(yu)被(bei)酯(zhi)酶降(jiang)(jiang)解的(de)(de)伯酯(zhi)取代(dai)每(mei)個(ge)(ge)烷基鏈(lian)中(zhong)兩個(ge)(ge)雙鍵中(zhong)的(de)(de)一個(ge)(ge)而(er)產生的(de)(de)[68]。觀(guan)察到脂(zhi)(zhi)質(zhi)319在(zai)(zai)肝(gan)臟中(zhong)的(de)(de)半衰期小(xiao)于(yu)(yu)1小(xiao)時，而(er)其在(zai)(zai)肝(gan)臟中(zhong)保持(chi)與MC3相似的(de)(de)基因(yin)沉默效(xiao)率。在(zai)(zai)體內(nei)證(zheng)實了(le)降(jiang)(jiang)解產物，以及其分泌和脂(zhi)(zhi)質(zhi)319的(de)(de)無(wu)毒性(xing)質(zhi)。在(zai)(zai)SARS-CoV-2的(de)(de)臨(lin)床前和臨(lin)床研(yan)究中(zhong)引用(yong)(yong)(yong)了(le)脂(zhi)(zhi)質(zhi)319的(de)(de)研(yan)究，作為BioNTech[49]和CureVac[53,69]產品(pin)中(zhong)使(shi)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)Acuitas LNP類別，盡管在(zai)(zai)倫敦帝國理(li)工學院試驗[60]中(zhong)Acuitas LNP遞送的(de)(de)自(zi)擴增RNA被(bei)引用(yong)(yong)(yong)為包(bao)含在(zai)(zai)最近的(de)(de)專利申請中(zhong)[59]，這(zhe)里(li)由Acuitas的(de)(de)Lipid A9代(dai)表(biao)（表(biao)2）。最近，BioNTech批準(zhun)的(de)(de)BNT162b2中(zhong)Acuitas可(ke)(ke)電(dian)離脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)同一性(xing)被(bei)披露為ALC-0315[40]（表(biao)2）。這(zhe)些LNPs的(de)(de)一個(ge)(ge)重(zhong)(zhong)要(yao)方面是，它們(men)是通(tong)過篩選IV給藥(yao)后肝(gan)臟中(zhong)的(de)(de)mRNA表(biao)達(da)而(er)開發的(de)(de)，可(ke)(ke)能(neng)還沒(mei)有(you)完(wan)全優化用(yong)(yong)(yong)于(yu)(yu)基于(yu)(yu)mRNA的(de)(de)疫(yi)苗(miao)的(de)(de)肌內(nei)給藥(yao)。

Moderna最(zui)近開發(fa)了(le)一(yi)類新的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)來替(ti)代MC3，主要是(shi)由(you)(you)于(yu)(yu)上(shang)述(shu)與(yu)(yu)(yu)(yu)MC3降(jiang)解(jie)(jie)緩慢相(xiang)(xiang)(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)問(wen)題，但也努力通(tong)過實(shi)現(xian)比二(er)(er)亞油酸MC3烷(wan)基尾(wei)更(geng)大(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分支(zhi)(zhi)來提高其效力[42,101]。這(zhe)(zhe)類新脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)具有(you)乙醇胺可(ke)(ke)(ke)電離(li)頭基，與(yu)(yu)(yu)(yu)含有(you)一(yi)級降(jiang)解(jie)(jie)酯（如Maier 2013）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單個(ge)(ge)(ge)飽和尾(wei)連接，并(bing)與(yu)(yu)(yu)(yu)第二(er)(er)個(ge)(ge)(ge)飽和尾(wei)連接，后(hou)者使(shi)用降(jiang)解(jie)(jie)性(xing)(xing)(xing)較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)(er)級酯在(zai)(zai)(zai)(zai)7個(ge)(ge)(ge)碳原子后(hou)分支(zhi)(zhi)成兩個(ge)(ge)(ge)飽和C8尾(wei)，如脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5[101]（表2）。優化用于(yu)(yu)肝臟IV給藥，發(fa)現(xian)相(xiang)(xiang)(xiang)似(si)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)H[42]或(huo)SM-102是(shi)疫(yi)苗肌內(nei)(nei)(IM)給藥的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)佳選(xuan)擇。分支(zhi)(zhi)增加(jia)是(shi)Acuitas追求(qiu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)共同特征(zheng)，因(yin)為Lipid A9共有(you)5個(ge)(ge)(ge)分支(zhi)(zhi)鏈[59]（表2），而(er)Moderna LNPs有(you)3個(ge)(ge)(ge)分支(zhi)(zhi)鏈。分支(zhi)(zhi)增加(jia)被認為可(ke)(ke)(ke)產生具有(you)更(geng)多(duo)錐形(xing)結(jie)(jie)構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)，因(yin)此，當與(yu)(yu)(yu)(yu)內(nei)(nei)體中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陰離(li)子磷(lin)脂(zhi)(zhi)配(pei)對時，將發(fa)生更(geng)大(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜破壞(huai)能(neng)(neng)力，遵循幾十年前概(gai)述(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子形(xing)狀(zhuang)假設(she)[12,91]。當IV給藥時，24h時在(zai)(zai)(zai)(zai)肝臟中(zhong)(zhong)檢測不(bu)到脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5，而(er)MC3以其初(chu)始劑(ji)量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)71%存在(zai)(zai)(zai)(zai)于(yu)(yu)肝臟中(zhong)(zhong)，驗證(zheng)Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)降(jiang)解(jie)(jie)性(xing)(xing)(xing)。IV給藥后(hou)，Lipid 5在(zai)(zai)(zai)(zai)小鼠(shu)中(zhong)(zhong)熒光素酶表達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效力是(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)3倍(bei)(bei)，在(zai)(zai)(zai)(zai)非(fei)人靈(ling)長類動物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)hEPO的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效力是(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5倍(bei)(bei)。這(zhe)(zhe)些效力的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)與(yu)(yu)(yu)(yu)胞(bao)內(nei)(nei)體釋放(fang)增加(jia)一(yi)致(zhi)，可(ke)(ke)(ke)能(neng)(neng)是(shi)由(you)(you)胞(bao)內(nei)(nei)體釋放(fang)增加(jia)引起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，對于(yu)(yu)Lipid 5，細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)高達15%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA從(cong)胞(bao)內(nei)(nei)體釋放(fang)，而(er)MC3為2.5%，后(hou)者與(yu)(yu)(yu)(yu)之前使(shi)用siRNA測定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)果相(xiang)(xiang)(xiang)似(si)[106]。然而(er)，在(zai)(zai)(zai)(zai)這(zhe)(zhe)些內(nei)(nei)體釋放(fang)實(shi)驗中(zhong)(zhong)，MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)攝取是(shi)Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)4倍(bei)(bei)，因(yin)此這(zhe)(zhe)兩種LNPs在(zai)(zai)(zai)(zai)細(xi)(xi)胞(bao)質(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)釋放(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)絕對量相(xiang)(xiang)(xiang)似(si)。在(zai)(zai)(zai)(zai)疫(yi)苗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肌內(nei)(nei)給藥中(zhong)(zhong)檢查了(le)相(xiang)(xiang)(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)(ke)電離(li)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)庫(ku)，同樣(yang)發(fa)現(xian)可(ke)(ke)(ke)降(jiang)解(jie)(jie)，并(bing)且由(you)(you)于(yu)(yu)伯酯而(er)迅速消除，并(bing)且對于(yu)(yu)流感核苷修飾(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA%__，與(yu)(yu)(yu)(yu)MC3相(xiang)(xiang)(xiang)比，在(zai)(zai)(zai)(zai)蛋白表達或(huo)免疫(yi)原性(xing)(xing)(xing)方面效價通(tong)常增加(jia)3-6倍(bei)(bei)。小鼠(shu)中(zhong)(zhong)%編(bian)碼的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)原，盡(jin)管(guan)非(fei)人靈(ling)長類動物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)原性(xing)(xing)(xing)與(yu)(yu)(yu)(yu)5µg初(chu)免-加(jia)強免疫(yi)劑(ji)量下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3相(xiang)(xiang)(xiang)同[42]。脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)H或(huo)SM-102（表2）被確定為最(zui)佳候(hou)選(xuan)藥物(wu)(wu)，在(zai)(zai)(zai)(zai)結(jie)(jie)構(gou)上(shang)僅(jin)與(yu)(yu)(yu)(yu)通(tong)過伯酯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二(er)(er)碳置換確定為IV給藥最(zui)佳的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5不(bu)同。脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)5 LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為6.56，而(er)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)H LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為6.68，表明(ming)IM與(yu)(yu)(yu)(yu)IV給藥相(xiang)(xiang)(xiang)比，pKa略微增加(jia)可(ke)(ke)(ke)能(neng)(neng)有(you)益(yi)，盡(jin)管(guan)該差異在(zai)(zai)(zai)(zai)試驗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變異性(xing)(xing)(xing)范圍內(nei)(nei)。大(da)(da)(da)鼠(shu)肌肉注射(she)部(bu)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組織學檢查表明(ming)，與(yu)(yu)(yu)(yu)MC3相(xiang)(xiang)(xiang)比，Lipid HLNPs吸引的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)性(xing)(xing)(xing)粒細(xi)(xi)胞(bao)和巨噬(shi)細(xi)(xi)胞(bao)富(fu)集的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)炎性(xing)(xing)(xing)浸(jin)潤較少(shao)，這(zhe)(zhe)可(ke)(ke)(ke)能(neng)(neng)會降(jiang)低人體試驗中(zhong)(zhong)注射(she)部(bu)位的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反應原性(xing)(xing)(xing)[42]。

目前SARS-CoV-2臨床試驗中的mRNA脂質納米顆粒(li)

5.1.BioNTech/Pfizer

Acuitas ALC-0315（表2）結(jie)合DSPC、膽(dan)固醇和PEG脂質是BioNTech SARS-COV-2試驗中的遞送系統[40]。CureVac和倫(lun)敦帝國(guo)理工學院也可(ke)能(neng)使(shi)用ALC-0315，或可(ke)能(neng)使(shi)用A9（表2）。

BioNTech開始用(yong)4種(zhong)(zhong)mRNA編碼的(de)(de)免疫原開發其SARS-CoV-2疫苗，其中2種(zhong)(zhong)是核苷修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)，1種(zhong)(zhong)是未(wei)修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)，1種(zhong)(zhong)是自我擴增的(de)(de)。有兩種(zhong)(zhong)核苷修(xiu)(xiu)飾的(de)(de)mRNA的(de)(de)報道(dao)：BNT162b1是編碼刺(ci)突蛋(dan)白(bai)受體結合(he)域的(de)(de)短的(de)(de)~1kb序列，通(tong)過foldon三聚體結構域修(xiu)(xiu)飾，通(tong)過多價顯示增加(jia)免疫原性。較長(chang)的(de)(de)4.3kb BNT162b2編碼一個二脯氨(an)酸穩(wen)定的(de)(de)全長(chang)膜結合(he)刺(ci)突蛋(dan)白(bai)。BNT162b2最近獲得了(le)歐盟和美(mei)國(guo)的(de)(de)緊急批(pi)準(zhun)。

在一(yi)項(xiang)臨床前(qian)研究中，小鼠單次給予0.2、1和(he)(he)(he)5µg BNT162b2后，可檢測到結(jie)合(he)抗(kang)(kang)體和(he)(he)(he)中和(he)(he)(he)滴(di)度(du)。從最低劑(ji)量(liang)(liang)到最高劑(ji)量(liang)(liang)增(zeng)加一(yi)個數量(liang)(liang)級，在Th2細胞因子水(shui)平非常低的(de)CD4 + 和(he)(he)(he)CD8 + 脾(pi)細胞中引(yin)起(qi)強(qiang)烈的(de)抗(kang)(kang)原特(te)異性Th1 IFNγ和(he)(he)(he)IL-2應答(da)[49]。引(yin)流淋(lin)巴結(jie)中還含有(you)大(da)量(liang)(liang)生發中心B細胞以及CD4 + 和(he)(he)(he)CD8 + 濾泡輔助性T(Tfh)細胞計數升高，這些細胞先前(qian)被(bei)(bei)確定為mRNA LNP疫(yi)(yi)苗中LNP單獨誘導的(de)一(yi)部分(fen)[33]。在非人(ren)靈長類動物(wu)中，30µg或100µg的(de)初免(mian)-加強(qiang)免(mian)疫(yi)(yi)劑(ji)量(liang)(liang)引(yin)起(qi)的(de)結(jie)合(he)抗(kang)(kang)體和(he)(he)(he)中和(he)(he)(he)滴(di)度(du)是人(ren)恢復期試驗組的(de)10倍以上，并且產生強(qiang)烈的(de)Th1偏(pian)倚T細胞應答(da)，該應答(da)被(bei)(bei)認為對預防疫(yi)(yi)苗相關的(de)增(zeng)強(qiang)呼吸道疾(ji)病很重要[107]。在有(you)限數量(liang)(liang)(6)的(de)攻毒(du)(du)恒河猴中，兩次100µg劑(ji)量(liang)(liang)在支氣管肺泡灌(guan)洗和(he)(he)(he)鼻拭子中檢測不到病毒(du)(du)滴(di)度(du)。

較小mRNA編碼免(mian)疫原BNT162b1的(de)1期臨床試驗計劃在第1天和第21天給予10、30和100µg劑(ji)量。中(zhong)等劑(ji)量30µg誘導的(de)抗體結合(he)和中(zhong)和滴度分別是人恢復期組的(de)30倍和3倍。由于首(shou)次(ci)給藥后(hou)(hou)存(cun)在重(zhong)度注(zhu)射(she)部(bu)位疼(teng)痛，因此(ci)未給予100µg劑(ji)量進行加(jia)強劑(ji)量。30µg加(jia)強劑(ji)量組100%的(de)受(shou)(shou)試者報告了(le)注(zhu)射(she)部(bu)位疼(teng)痛，但嚴重(zhong)程度為輕(qing)度或(huo)中(zhong)度。以30µg劑(ji)量第二次(ci)接種疫苗后(hou)(hou)，幾乎(hu)所有受(shou)(shou)試者均發生輕(qing)度或(huo)中(zhong)度全身不良事件發熱、寒戰或(huo)疲乏。該試驗還(huan)證(zheng)明了(le)外周血單核細胞對Th1偏倚T細胞的(de)強烈應答[50]。

一(yi)項(xiang)2期(qi)試驗(yan)在(zai)年(nian)輕（18-55歲(sui)）和(he)年(nian)長（65-85歲(sui)）受(shou)(shou)試者(zhe)(zhe)組(zu)中(zhong)比(bi)較了(le)(le)BNT162b1和(he)BNT162b2[51]。老(lao)年(nian)受(shou)(shou)試者(zhe)(zhe)的(de)結合和(he)中(zhong)和(he)抗體滴度(du)(du)略低，但(dan)仍超過恢復期(qi)組(zu)。與年(nian)輕受(shou)(shou)試者(zhe)(zhe)相比(bi)，老(lao)年(nian)受(shou)(shou)試者(zhe)(zhe)的(de)不(bu)(bu)良反應嚴(yan)重程度(du)(du)也降低。與BNT162b1相比(bi)，在(zai)BNT162b2中(zhong)發(fa)現全身不(bu)(bu)良事件(jian)（發(fa)熱(re)、寒戰、疲乏）的(de)頻(pin)率(lv)顯(xian)著降低約兩(liang)倍。正是BNT162b2耐受(shou)(shou)性(xing)的(de)增加推動(dong)了(le)(le)其選擇進入3期(qi)試驗(yan)，最近宣布了(le)(le)94%的(de)有效性(xing)，因為(wei)在(zai)安慰劑組(zu)中(zhong)發(fa)生了(le)(le)162例COVID-19病(bing)例，而在(zai)接(jie)受(shou)(shou)兩(liang)次30µg BNT162b2給藥的(de)疫苗接(jie)種(zhong)組(zu)中(zhong)僅發(fa)現了(le)(le)8例病(bing)例[3]

5.2. Moderna

在(zai)(zai)Moderna的研究中，核(he)苷修飾的mRNA編(bian)碼免疫原(yuan)是一種(zhong)跨膜(mo)錨定(ding)的二脯氨(an)酸穩定(ding)的融(rong)合(he)前刺突，具有(you)天然的furin裂解位點，并在(zai)(zai)原(yuan)型MC3 LNP基礎上(shang)的LNP中遞送，只是用(yong)Lipid H(SM-102)替(ti)代(dai)MC3[41,42]。該mRNA LNP(mRNA-1273)在(zai)(zai)第1天和(he)(he)(he)第21天以1µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)(liang)注射(she)時(shi)在(zai)(zai)幾種(zhong)小鼠(shu)種(zhong)屬中誘導中和(he)(he)(he)抗體，但(dan)在(zai)(zai)0.1µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)(liang)時(shi)未(wei)誘導中和(he)(he)(he)抗體[44]。T細胞(bao)應(ying)答似乎(hu)是平衡的Th1/Th2應(ying)答，在(zai)(zai)小鼠(shu)適應(ying)的病(bing)毒攻毒模型中，小鼠(shu)肺(fei)和(he)(he)(he)鼻(bi)甲中的病(bing)毒滴度(du)在(zai)(zai)2次劑(ji)(ji)量(liang)(liang)(liang)1µg給藥后(hou)降低(di)至基線(xian)(xian)，但(dan)在(zai)(zai)0.1µg給藥后(hou)未(wei)降低(di)。在(zai)(zai)恒(heng)河(he)猴中，2劑(ji)(ji)100µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)(liang)在(zai)(zai)外周血(xue)中產(chan)生高結合(he)和(he)(he)(he)中和(he)(he)(he)滴度(du)以及(ji)Th1偏倚反應(ying)，也涉及(ji)強烈的Tfh反應(ying)[45]。兩個(ge)10µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)(liang)組(zu)的滴度(du)和(he)(he)(he)T細胞(bao)應(ying)答顯著降低(di)。同(tong)樣，100µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)(liang)能夠將支氣管肺(fei)泡灌洗液(ye)和(he)(he)(he)鼻(bi)拭(shi)子(zi)中的病(bing)毒滴度(du)降低(di)至基線(xian)(xian)，而10µg僅在(zai)(zai)肺(fei)部降低(di)。

在(zai)1期(qi)(qi)(qi)研(yan)究中，每組15例(li)患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)接(jie)受(shou)(shou)2劑(ji)25、100或250µg，間(jian)隔4周(zhou)，結合(he)和(he)(he)(he)中和(he)(he)(he)滴度(du)比100µg劑(ji)量的(de)(de)恢(hui)(hui)(hui)復期(qi)(qi)(qi)高約(yue)10倍，約(yue)相當(dang)于(yu)25µg的(de)(de)恢(hui)(hui)(hui)復期(qi)(qi)(qi)[46]。100µg和(he)(he)(he)250µg劑(ji)量組所有(you)(you)受(shou)(shou)試者(zhe)(zhe)(zhe)均報告征集(ji)性不良事件(jian)(jian)，250µg組14例(li)受(shou)(shou)試者(zhe)(zhe)(zhe)中的(de)(de)3例(li)報告重(zhong)(zhong)度(du)不良事件(jian)(jian)并停藥。在(zai)隨后(hou)(hou)的(de)(de)老年患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)（56-71歲(sui)和(he)(he)(he)71歲(sui)以上）1期(qi)(qi)(qi)研(yan)究中，發(fa)現(xian)(xian)25µg和(he)(he)(he)100µg劑(ji)量產生的(de)(de)結合(he)抗體滴度(du)高于(yu)恢(hui)(hui)(hui)復期(qi)(qi)(qi)血漿，而100µg劑(ji)量的(de)(de)中和(he)(he)(he)滴度(du)相當(dang)，但低于(yu)25µg劑(ji)量的(de)(de)恢(hui)(hui)(hui)復期(qi)(qi)(qi)[43]。大(da)多數(shu)患(huan)(huan)者(zhe)(zhe)(zhe)（約(yue)80%）在(zai)第二次接(jie)種疫苗后(hou)(hou)仍(reng)發(fa)生不良事件(jian)(jian)，即(ji)使(shi)是在(zai)老年組。外(wai)周(zhou)血分析(xi)顯(xian)示(shi)(shi)CD4 T細胞(bao)應答存在(zai)Th1偏(pian)倚。與(yu)25µg劑(ji)量相比，100µg劑(ji)量的(de)(de)中和(he)(he)(he)滴度(du)更高，因此選擇該劑(ji)量用于(yu)3期(qi)(qi)(qi)試驗，中期(qi)(qi)(qi)結果顯(xian)示(shi)(shi)90例(li)COVID-19病例(li)在(zai)安慰劑(ji)組與(yu)5例(li)在(zai)疫苗接(jie)種組具(ju)有(you)(you)94.5%的(de)(de)有(you)(you)效性[2]。一(yi)個獨立的(de)(de)委(wei)員會對Moderna的(de)(de)3期(qi)(qi)(qi)試驗進(jin)行了(le)中期(qi)(qi)(qi)分析(xi)，發(fa)現(xian)(xian)嚴重(zhong)(zhong)不良事件(jian)(jian)包括9.7%的(de)(de)參與(yu)者(zhe)(zhe)(zhe)出(chu)現(xian)(xian)疲(pi)勞，8.9%出(chu)現(xian)(xian)肌肉(rou)疼(teng)痛，5.2%出(chu)現(xian)(xian)關(guan)節痛，4.5%出(chu)現(xian)(xian)頭(tou)痛，而在(zai)輝瑞/BioNTech的(de)(de)3期(qi)(qi)(qi)試驗中，頻率較低的(de)(de)是疲(pi)勞為3.8%，頭(tou)痛為2%[108]。

5.3. CureVac

The CureVac mRNA LNP(CVnCoV)是(shi)一種非化(hua)學修飾的(de)序列(lie)工程mRNA，編碼(ma)在(zai)(zai)Acuitas LNP中(zhong)(zhong)遞送(song)的(de)二脯(fu)氨酸穩(wen)定的(de)全長S蛋白，可能使用可電離脂質ALC-0315。在(zai)(zai)小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)使用2µg劑量(liang)時，檢查了兩(liang)次(ci)給藥(yao)之間的(de)周數，范圍為1-4周，發現Balb/c小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)較長的(de)間隔產(chan)(chan)生了較高的(de)滴(di)度和T細胞應答以及平衡的(de)Th1/Th2應答[53]。需要第二次(ci)給藥(yao)以產(chan)(chan)生中(zhong)(zhong)和抗體，0.25µg的(de)兩(liang)次(ci)給藥(yao)不足(zu)以產(chan)(chan)生中(zhong)(zhong)和抗體。在(zai)(zai)敘利亞金黃地鼠(shu)中(zhong)(zhong)，兩(liang)次(ci)10µg劑量(liang)（而(er)非2µg）能夠(gou)將肺（而(er)非鼻甲）中(zhong)(zhong)的(de)病(bing)毒滴(di)度降低至基線。

在檢(jian)查2-12µg劑量的(de)1期臨床試(shi)驗中(zhong)(zhong)，僅在最高12µg劑量下發(fa)現達到恢復期血清水平(ping)的(de)中(zhong)(zhong)和(he)滴度，導致正(zheng)在進行的(de)2期試(shi)驗納入更高劑量16和(he)20µg[52]。接受12µg劑量的(de)所(suo)有患(huan)者在每(mei)次(ci)給藥后均(jun)發(fa)生全身不良事件，大多數為中(zhong)(zhong)度和(he)重度，而 > 80%的(de)患(huan)者在輕度和(he)中(zhong)(zhong)度水平(ping)發(fa)生局(ju)部注(zhu)射(she)部位疼痛(tong)。

5.4. TranslateBio

Translate Bio使用(yong)非(fei)修飾的(de)(de)mRNA編(bian)碼雙突變(bian)形(xing)式的(de)(de)二脯氨酸穩(wen)定的(de)(de)刺(ci)突蛋白(bai)，并通過(guo)(guo)被引用(yong)為基于可電離(li)脂質C12-200[109]的(de)(de)LNP進行(xing)遞送，其(qi)可能是最(zui)近從(cong)ICE-[110]或基于半胱(guang)氨酸的(de)(de)[55]可電離(li)脂質家族合成的(de)(de)候選物。在(zai)Balb/c小鼠中，0.2–10µg范(fan)圍內的(de)(de)兩次給(gei)藥導致結合和(he)中和(he)滴(di)(di)度遠高于恢復期水平。在(zai)非(fei)人靈長類動物中，15、45和(he)135µg劑(ji)量產(chan)生(sheng)的(de)(de)滴(di)(di)度均超過(guo)(guo)人恢復期組[56]。免疫應答也存在(zai)Th1偏倚。

5.5. Arcturus

Arcturus使用(yong)自(zi)擴增、全(quan)長、未修飾(shi)的mRNA編(bian)碼(ma)融合前SARS-CoV-2全(quan)長刺突(tu)蛋白，通過LNP進行遞送，該LNP使用(yong)可(ke)電離(li)脂質(zhi)(zhi)與硫(liu)酯(zhi)，通過兩(liang)個(ge)額(e)外的酯(zhi)基(ji)將含胺(an)的頭基(ji)與脂質(zhi)(zhi)尾(wei)部連接(jie)。該家族中兩(liang)種可(ke)能的可(ke)電離(li)脂質(zhi)(zhi)是脂質(zhi)(zhi)10a（[111]的表4）或脂質(zhi)(zhi)2,2(8,8)4 C CH3（[57]的第33頁）（表2）。后(hou)者(zhe)有三個(ge)分支(zhi)，類(lei)似于Moderna Lipid H，但(dan)有一(yi)個(ge)可(ke)降(jiang)解的硫(liu)酯(zhi)與頭基(ji)連接(jie)。觀察到自(zi)身擴增mRNA的特征，即(ji)IM給藥后(hou)1周以上，熒光素酶(mei)報告基(ji)因表達維持在相當恒定的水平(ping)，而(er)常規mRNA表達迅速下降(jiang)[58]。

單獨(du)接(jie)種疫(yi)苗在C57BL/6小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)中產生了令人(ren)驚訝地體重(zhong)減(jian)輕和臨(lin)床評分(fen)增加(jia)。小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)中僅需要2µg或10µg（而非(fei)0.2µg）單次給藥，即(ji)可在Th1偏倚應(ying)答中達(da)到高(gao)于100的中和滴(di)度，并具(ju)有高(gao)水平(ping)的抗原特異性T細胞應(ying)答。在K18-hACE2致死小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)激發模型中，2µg或10µg單次給藥也具(ju)有100%保(bao)護作用，100%存活，無體重(zhong)減(jian)輕，肺和腦病毒滴(di)度降低至基線(xian)水平(ping)。Arcturus已(yi)經完(wan)成(cheng)了1期臨(lin)床試驗，劑量為1-10µg，并選擇7.5µg進行3期試驗[112]。

5.6.帝國(guo)理工學院(yuan)

倫敦帝(di)國理工學院使用Acuitas LNP遞送(song)的(de)(de)自擴增mRNA編碼的(de)(de)融(rong)合(he)前穩定的(de)(de)刺突蛋白(bai)，該(gai)LNP在Lipid A9[60]代(dai)表的(de)(de)專利[59]中進行了(le)描(miao)述（表2）。在Balb/c小鼠兩次注射0.01µg至(zhi)10µg劑量范(fan)圍后(hou)，獲得了(le)較高的(de)(de)劑量依賴性(xing)抗體和(he)(he)中和(he)(he)滴度。該(gai)應(ying)答存在強(qiang)烈的(de)(de)Th1偏倚，與(yu)較低的(de)(de)0.1和(he)(he)0.01µg劑量相(xiang)比，10和(he)(he)1µg劑量產生的(de)(de)抗原特異性(xing)脾細(xi)胞應(ying)答高3倍。這(zhe)種疫苗的(de)(de)1期臨床試驗(yan)即將開始。

5.7.朱(zhu)拉(la)隆功大(da)學、賓(bin)夕法尼亞(ya)大(da)學

朱(zhu)拉隆功大學與賓夕法(fa)尼(ni)亞(ya)大學合作，正在(zai)使(shi)用Genevant LNP（可能是(shi)(shi)CL1脂(zhi)質(zhi)）開(kai)發一種天然的(de)(de)加標免疫原核苷(gan)修飾的(de)(de)mRNA LNP[61]。他們的(de)(de)目標是(shi)(shi)在(zai)2021年(nian)第(di)1季(ji)度開(kai)始(shi)1期臨(lin)床試驗，并在(zai)2021年(nian)第(di)4季(ji)度開(kai)始(shi)將疫苗分發給泰國(guo)和7個周(zhou)圍的(de)(de)低至中等收(shou)入國(guo)家。

5.8. Providence Therapeutics

Providence Therapeutics被授予(yu)加(jia)拿(na)大衛生部許(xu)可(ke)(ke)進(jin)(jin)行(xing)PTX-COVID-19B mRNA LNP疫苗(miao)人(ren)體(ti)臨(lin)(lin)床試驗的(de)(de)通知[113]。C57BL6小(xiao)鼠按照初(chu)免-加(jia)強免疫方案接受(shou)20µg劑量給藥后，對編碼受(shou)體(ti)結(jie)合域(yu)（furin裂解位(wei)點有(you)或無突變的(de)(de)全長加(jia)標物(wu)）的(de)(de)三種(zhong)mRNA候選(xuan)物(wu)進(jin)(jin)行(xing)臨(lin)(lin)床前研究(jiu)[114]。來自Genevant未披露(lu)脂質(zhi)的(de)(de)臨(lin)(lin)床前數據(ju)結(jie)果（可(ke)(ke)能與(yu)表2中的(de)(de)CL1相似(si)）顯示(shi)出對于全長和furin突變有(you)效負(fu)載的(de)(de)穩(wen)健中和滴度，與(yu)[115]中觀察到的(de)(de)數據(ju)相似(si)。1期臨(lin)(lin)床試驗計劃于2021年第一(yi)季度開始(shi)，疫苗(miao)的(de)(de)生產和分(fen)銷——等待監管(guan)批準——在同年進(jin)(jin)行(xing)。

5.9.儲存(cun)和分(fen)銷

大多數在(zai)實驗室中(zhong)制造的RNA LNPs在(zai)4 °C下可(ke)穩(wen)定數天，但隨后表現出(chu)體(ti)積增(zeng)大和生(sheng)物(wu)活性(xing)逐漸(jian)喪(sang)失(shi)，如(ru)熒光(guang)素酶(mei)表達(da)[116]。在(zai)之(zhi)(zhi)前的siRNA LNP制劑(ji)中(zhong)，通(tong)常觀察到LNP聚集(ji)的大小隨時間增(zeng)加(jia)[117]。為(wei)了穩(wen)定用于儲存(cun)和分銷的mRNA LNP疫苗，迄今為(wei)止需要(yao)(yao)冷凍(dong)形(xing)式。Moderna COVID-19疫苗需要(yao)(yao)在(zai)-25 ℃～-15 ℃保存(cun)，但在(zai)2 ℃～8 ℃之(zhi)(zhi)間也可(ke)穩(wen)定長(chang)達(da)30天，在(zai)8 ℃～25 ℃之(zhi)(zhi)間可(ke)穩(wen)定長(chang)達(da)12 h[118]。輝瑞/BioNTech COVID-19疫苗需要(yao)(yao)在(zai)-80 ℃至-60 ℃下儲存(cun)，然(ran)后解凍(dong)并在(zai)2 ℃至8 ℃下儲存(cun)長(chang)達(da)5天，然(ran)后在(zai)注射前用生(sheng)理(li)鹽(yan)水稀(xi)釋[119]。

與(yu)Moderna疫(yi)(yi)苗所(suo)需(xu)的常規冷凍溫度相(xiang)比，輝(hui)瑞疫(yi)(yi)苗在分(fen)銷和儲存(cun)期間所(suo)需(xu)的干冰溫度更難達到(dao)。這(zhe)些溫差背后(hou)的原因(yin)并不明顯，因(yin)為兩種疫(yi)(yi)苗均含(han)有相(xiang)似(si)的高濃度蔗(zhe)糖作為冷凍保護(hu)劑。Moderna mRNA LNPs在Tris和醋酸鹽兩種緩(huan)沖(chong)液中(zhong)冷凍[41]，而(er)Pfizer/BioNTech疫(yi)(yi)苗僅使用磷(lin)酸鹽緩(huan)沖(chong)液[40]。已(yi)知磷(lin)酸鹽緩(huan)沖(chong)液對冷凍不理想，因(yin)為其易于沉淀，并在冰結晶開始時引起pH值突然變化(hua)[120,121]。凍干對于mRNA LNPs一直具有挑戰(zhan)性[116]。然而(er)，Arcturus表示，他(ta)們的COVID-19 mRNA疫(yi)(yi)苗在凍干形式下(xia)是穩定(ding)的，這(zhe)大概會大大簡化(hua)分(fen)布，盡管這(zhe)種凍干制劑的溫度穩定(ding)性尚未披露[122]。

原文(wen)來源：Automated Manufacture of Autologous CD19 CAR-T Cells for Treatment of Non-hodgkin Lymphoma.Front.Immunol.11:1941. DOI:10.3389/fimmu.2020.01941